本試驗(yàn)旨在研究飼料中添加抗菌肽(AMPs)對(duì)草魚腸道形態(tài)功能和健康狀況的影響。
選擇健康，大小相近的草魚540尾，隨機(jī)分為6個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。M0組飼喂基礎(chǔ)日糧（對(duì)照組，未添加抗菌肽），M1、M2、M3、M4和M5組分別在基礎(chǔ)日糧中添加100mg/kg、200mg/kg、400 mg/kg、800 mg/kg和1600 mg/kg抗菌肽，試驗(yàn)期8周。
| 組別 | 日糧 |
| M0 | 基礎(chǔ)日糧+0mg/kg |
| M1 | 基礎(chǔ)日糧+100mg/kg |
| M2 | 基礎(chǔ)日糧+200mg/kg |
| M3 | 基礎(chǔ)日糧+400mg/kg |
| M4 | 基礎(chǔ)日糧+800mg/kg |
| M5 | 基礎(chǔ)日糧+1600mg/kg |
1、抗菌肽對(duì)草魚腸道形態(tài)及酶活性的影響
由表1可見，與M0組相比，添加抗菌肽組后腸道淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶水平和總抗氧化能力(T-AOC)顯著升高(P< 0.05)，丙二醛(MDA)含量顯著降低。組織學(xué)分析顯示，M4組前腸和中腸絨毛高度和隱窩深度與M0組相比差異顯著(P<0.05)。
表1 抗菌肽對(duì)草魚腸道形態(tài)及酶活性的影響
數(shù)據(jù)以mean±SD表示(n=3)，無共同字母的數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；T-AOC：總抗氧化能力。
2、日糧中免疫抗體對(duì)腸道免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響
由圖1可見，草魚腸道中錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、促炎細(xì)胞因子（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素8（IL8）、白細(xì)胞介素10（IL10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的表達(dá)水平。MnSOD各組無顯著差異（圖1a）和IL8的表達(dá)水平（圖1c）在所有組之間無顯著差異（P>0.05），但M3的表達(dá)水平在所有組中最高。TNF-α的mRNA水平（圖1d）在M3中達(dá)到峰值（P<0.05）。與其它組相比，M3組IL-1β的表達(dá)水平（圖1b）顯著上調(diào)（P<0.05）。隨著添加量增加，IL10和TGF-β在草魚腸道中的表達(dá)均先降低，然后緩慢增加，在M3組中達(dá)到最低表達(dá)水平。IL10的表達(dá)水平（圖1e）和TGF-β（圖1f）在M3組中的表達(dá)水平與其它組相比顯著下調(diào)（P<0.05）。圖1（g–k）顯示嗜水氣單胞菌攻擊后，所有組的腸中IL-1β、IL8、TNF-α、IL10和TGF-α的mRNA水平。與對(duì)照組相比，添加抗菌肽組M0-Ah中IL-1β的表達(dá)水平顯著增加（P<0.05）。與M0-M2相比，M3、M4和M5IL8（圖1h）和TNF-α（圖1i）的表達(dá)有顯著下調(diào)趨勢(shì)（P<0.05）。IL10的mRNA水平?jīng)]有顯著差異（圖1j）在所有組之間（除M1-Ah外）（P>0.05）。草魚腸道中，TGF-β的表達(dá)水平（圖1k）在M3-Ah達(dá)到峰值，與其他組相比有顯著差異（P<0.05）。
圖1.飼喂AMP (a-e)和攻毒嗜水單胞菌(g-k)后草魚腸道免疫相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果針對(duì)β-肌動(dòng)蛋白歸一化。數(shù)據(jù)以mean±SD表示(n = 3)。
3、腸道微生物區(qū)系的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群
3.1 腸道菌群的多樣性和豐富性
各組Shannon、Simpson、Chao和Ace指數(shù)沒有顯著差異（圖2a-d），而在Shannon指數(shù)中，NC組和M5-Ah與M0-Ah相比，顯著增加（圖2e）；在Ace指數(shù)（圖2g）和Chao（圖2h）指數(shù)中，與NC組相比，M2-Ah、M3-Ah和M4-Ah顯著降低。β多樣性分析的結(jié)果可以反映物種組成在不同類群中的分布。因此，不同樣本中微生物群落的相似性或差異性可以使用主坐標(biāo)分析（PCoA）來識(shí)別，這是β多樣性分析之一（圖2ij）。結(jié)果（圖2i）顯示，在從M0中分離出來的所有添加抗菌肽組（M3除外）中都有一些相似的組成，圖2j顯示了M1至M5-Ah中比M0和NC組更多的重疊元素。
圖2.各組腸道菌群的多樣性和豐富性
3.2 腸道菌群的相對(duì)豐度
如圖3、圖4所示，變形菌門、厚壁菌門和梭桿菌門的群落豐度約占各組細(xì)菌總數(shù)的80%，梭桿菌門的豐度最小，而厚壁菌門、擬桿菌門和藍(lán)藻門在M4中最高（圖3a）、（圖4a）相對(duì)于其它各組。放線菌的群落豐度在M0中最高（圖3a），在M1中最低（圖3a）。在攻毒組中，放線菌在M0-Ah中的比例最低（圖4a）。衣原體在M0中的豐度最高（圖3a），其比例高于其它組，而酸桿菌在M4中最高（圖3a），在其它組中很少。圖3表明，與M0相比，添加抗菌肽組中浮游菌的相對(duì)豐度顯著下調(diào)（P<0.05）（圖3b），并在M3中達(dá)到最低水平（圖3b）。圖3c和g顯示M1和M5中浮游菌的相對(duì)豐度顯著降低（P<0.01），藍(lán)藻門的相對(duì)豐度。與M0組相比顯著增加（P<0.05）。此外，厚壁菌門的相對(duì)豐度在M3（p<0.01）和M4（P<0.05）中顯著增加，其中浮霉菌門的相對(duì)豐度比M0顯著降低（P<0.01）（圖3e-f）。M2和M0之間沒有顯著差異（圖3d）。酸桿菌門在NC組中的相對(duì)豐度顯著高于M0-Ah、M2-Ah、M3-Ah和M4-Ah（P<0.05）。此外，與M0-Ah相比，M4-Ah中梭桿菌門的相對(duì)豐度顯著降低（P<0.05）。
圖3.通過單因素方差分析比較六組腸道菌群的相對(duì)豐度
(a):門水平;(b):各組植物菌的相對(duì)豐度;(c): M0和M1的相對(duì)豐度;(d) M0和M2的相對(duì)豐度;(c): M0和M3的相對(duì)豐度;(d): M0和M4的相對(duì)豐度;(e): M0和M5的相對(duì)豐度。
圖4.通過單因素方差分析比較嗜水單胞桿菌攻毒組腸道菌群的相對(duì)豐度
(a):門水平;(b): NC和M0-Ah的相對(duì)豐度;(c): NC和M1-Ah的相對(duì)豐度;(d) NC和M2-Ah的相對(duì)豐度;(e): NC和M3-Ah的相對(duì)豐度;(f): NC和M4-Ah的相對(duì)豐度;(g): NC和M5-Ah的相對(duì)豐度;(h): M0-Ah和M1-Ah的相對(duì)豐度;(i): M0-Ah和M2-Ah的相對(duì)豐度;(j) M0-Ah和M3-Ah的相對(duì)豐度;(k): M0-Ah和M4-Ah的相對(duì)豐度;(l): M0-Ah和M5-Ah的相對(duì)豐度。
3.4 腸道菌群組成與免疫相關(guān)基因的相關(guān)性研究
如圖5所示，螺旋體門和異常球菌-棲熱菌門的相對(duì)豐度與IL-1β、MnSOD和TNF-α的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（P<0.05），而藍(lán)藻門和硝化螺旋菌門分別與IL10和IL-1β的表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)（P<0.05）。此外，變形菌門和異常球菌-棲熱菌門的相對(duì)豐度與IL8的mRNA表達(dá)水平之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。圖5b顯示，梭桿菌和衣原體的相對(duì)豐度與IL-1β的mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（P<0.05），但是，與酸桿菌和軟壁菌門呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），髕骨細(xì)菌門與IL8呈負(fù)相關(guān)。
圖5.免疫防御系統(tǒng)相關(guān)基因與培養(yǎng)組(a)和攻毒組(b)腸道微生物相對(duì)豐度在門水平上的相關(guān)性Pearson相關(guān)系數(shù)由不同顏色體現(xiàn)(青色黑色:正相關(guān);紫色:負(fù)相關(guān))。
本研究表明，在飼料中添加400~800 mg/kg的抗菌肽可以改善草魚腸道結(jié)構(gòu)，增加草魚腸道菌群的多樣性。此外，抗菌肽還能抑制某些致病菌，如嗜水氣單胞菌，增加厭氧菌數(shù)量，提高腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。但極高的劑量會(huì)抑制腸道消化、營(yíng)養(yǎng)吸收能力和微生物多樣性。抗菌肽已被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖以增強(qiáng)健康，但其與水生生物腸道菌群的相互作用還有待進(jìn)一步探索。
參考文獻(xiàn)
Shulin Liu,Shaodan Wang,Xuewei Liu, et al. Effects of dietary antimicrobial peptides on intestinal morphology, antioxidant status, immune responses, microbiota and pathogen disease resistance in grass carp Ctenopharyngodon idellus. Microbial Pathogenesis. 2022;165 (0):105386-105386.
翻譯：宋志恒
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